Kwantyfikacja białka kanału wodnego akwapodyny-CHIP w mikrokosmkach w kanalikach nerkowych za pomocą testu ELISA opartego na fluorescencji.

Kilka transporterów zostało zlokalizowanych wzdłuż nefronu metodami fizjologicznymi lub immunocytochemicznymi. Jednak faktyczna obfitość tych cząsteczek nie została ustalona. Aby osiągnąć ten cel, opracowaliśmy metodę ELISA opartą na fluorescencji i wykorzystaliśmy ją do ilościowego oznaczenia białka kanału wodnego Aquapiny-CHIP (AQP-CHIP) w kanalikach nerki szczura. Mikropęcherzykowe kanaliki (2 mm / próbka, permeabilizowane przy użyciu 0,5% Triton X-100) lub oczyszczone standardy AQP-CHIP (0-200 fmol) wykorzystano w protokole fluorescencyjnym ELISA po kowalencyjnym unieruchomieniu na kulkach Sepharose aktywowanych epoksydem. Niższy limit wykrywania wynosił 2,4 fmol AQP-CHIP. Wstępna absorpcja z nadmiarem oczyszczonego AQP-CHIP lub użycie surowicy nieimmunologicznej wyeliminowało sygnał. W segmentach proksymalnych zmierzony AQP-CHIP był liniowo powiązany z długością kanalików (1-10 mm). Zmierzony AQP-CHIP był (średni +/- SE, fmol / mm): S-1 proksymalny, 10,8 +/- 2,1; S-2, 10,0 +/- 2,3; S-3, 21,3 +/- 3,1; typ cienka ręka opadająca (DTL), 12,9 +/- 4,6; typ 2 DTL, 86,5 +/- 19,5; typ 3 DTL, 43,0 +/- 11,2. W cienkich wstępujących kończynach, grubych wstępujących kończynach, dystalnych zakrzepłych kanalikach, łączących kanalikach i zbierających kanałach sygnał AQP-CHIP był nie do odróżnienia od zera. W oparciu o jednostkową przewodność wody pojedynczych cząsteczek CHIP, nasze obliczenia pokazują, że zawartość AQP-CHIP jest wystarczająca do wyjaśnienia przenikalności wody mierzonej w izolowanych kanalikach proksymalnych i segmentach DTL.
[podobne: pokrzywka fizykalna, polipektomia endoskopowa, przetoka odbytu zdjęcia ]