Skip to content

Białko Mózgowe 14-3-3 w płynie mózgowo-rdzeniowym jako marker przenoszenia pasażowalnych encefalopatii gąbczastych ad

3 tygodnie ago

485 words

Próbki rozdzielano przez elektroforezę z dodecylosiarczanem sodu / poliakryloamidem na żelu (4-procentowy żel do układania w stos z 12% żelu rozdzielającego przy 75 V przez trzy godziny) i przenoszono na nitrocelulozę. Immunobarwienie przeprowadzono przez blokowanie za pomocą soli buforowanej TRIS zawierającej 0,3% Tween 20 przez 30 minut, a następnie inkubację z poliklonalnym króliczym przeciwciałem anty-14-3-3. (Santa Cruz Biotechnology, nr sc-629) w rozcieńczeniu 1: 500. a następnie przez inkubację ze skoniugowanym z alkaliczną fosfatazą przeciwciałem przeciwciałem IgG (BioSource International, nr ALI3405) w rozcieńczeniu 1: 1000. Antygen wykryto w reakcji kolorymetrycznej. Na każdym żelu umieszczono markery masy cząsteczkowej i kontrolę pozytywną (płyn mózgowo-rdzeniowy od pacjenta z potwierdzoną chorobą Creutzfeldta-Jakoba). Istotność statystyczną25 obliczono za pomocą testu chi-kwadrat i dokładnego testu Fishera dla tabel kontyngencji dwa na dwa . Wartości P mniejsze niż 0,05 uważano za wskazujące na istotność statystyczną. Przedziały ufności zostały obliczone przy użyciu dokładnej metody dla parametru dwumianowego.25
Wyniki
Identyfikacja, charakterystyka i weryfikacja białek 130 i 131 jako 14-3-3
Figura 1. Figura 1. Regiony żeli barwionych srebrem pokazujące plamy białkowe 130 i 131 po dwuwymiarowej elektroforezie. Panel A pokazuje normalny płyn mózgowo-rdzeniowy, z plamkami 130 i 131 nieobecnymi. Panel B pokazuje płyn mózgowo-rdzeniowy od pacjenta z chorobą Creutzfeldta-Jakoba; strzałki wskazują miejsca 130 i 131. Żele w panelach C i D pochodzą z ekstraktu normalnego ludzkiego mózgu. Panele A, B i C pokazują ten sam region żelu, z punktami izoelektrycznymi w zakresie od 4,8 do 6,0 (od lewej do prawej) na osi X i wielkości od 10 do 40 kD (od dołu do góry) na osi Y. Przerywana ramka w panelu C nakreśla obszar pokazany w panelu D z żelu o zakresie pH od 4,5 do 5,4. Strzałki w panelach B i C wskazują położenie plamek 130 i 131, które są oznaczone w panelu D.
Wyniki dwuwymiarowej elektroforezy dla wykrywania białek 130 i 131 płynu mózgowo-rdzeniowego u pacjentów z chorobą Creutzfeldta-Jakoba pokazano na Figurze 1A i Figurze 1B. Ostatnie udoskonalenia techniczne spowodowały zwiększenie rozdzielczości, z sześcioma punktami zamiast dwóch (odpowiadającymi białkom 130 i 131) oryginalnie opisanymi. Aby znaleźć obfite źródło tych białek, zbadaliśmy prawidłową tkankę mózgową, aby ustalić, czy jakiekolwiek białka mózgu znajdują się w pobliżu konstelacji plamek odpowiadających białkom 130 i 131 płynu mózgowo-rdzeniowego. Figura 1C przedstawia region wybarwionego srebrem żelu po dwuwymiarowa elektroforeza normalnych białek mózgu. Kilka białek występuje w tym samym obszarze, co konstelacja 130-131, w tym dwie, które mają ten sam ładunek i masę co konstelacja 130-131 w płynie mózgowo-rdzeniowym. Identyfikacja dwóch plamek na podstawie ich pozycji została potwierdzona badaniami migracyjnymi. Miejsce 130 oczyszczono za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy o wąskim zakresie (zakres pH, 4,5 do 5,4), jak pokazano na Figurze 1D.
Miejsce 130 wycięto z 10 plam, trawiono enzymatycznie i poddano mikro-sekwencji. Sekwencje aminokwasowe otrzymano z czterech fragmentów peptydowych
[przypisy: hurtownia portfeli, alprazolam, anakinra ]
[przypisy: przełyk barretta dieta, przepuklina mosznowa objawy, przetoka odbytu objawy ]